اهداف: روش های تخریب سلولی مختلفی برای استخراج پروتئین های داخل سیتوپلاسمی وجود دارد. هدف مطالعه حاضر انتخاب بهترین روش استخراج پروتئین امتزاجی نوترکیب تری پاراتید از میزبان باکتریایی اشریشیا کلی و دستیابی به بهترین شرایط تخلیص آن بود. مواد و روش ها: در مطالعه تجربی حاضر، سلول های باکتری با روش های سونیکاسیون با دورهای متفاوت، له کردن در نیتروژن مایع، هموژناسیون تحت دو فشار مختلف و روش شیمیایی شکسته شدند. نمونه های مربوط به رسوب و محلول رویی حاصل از هر روش، در ژل سدیم دودسیل سولفات الکتروفورز شدند. سلول های شکسته شده در محیط کشت لوریا برتانی جامد کشت و به روش گرم رنگ آمیزی شدند. کروماتوگرافی تمایلی نیکل برای خالص سازی پروتئین در شرایط واسرشته و غیرواسرشته به ترتیب با شیب pH و غلظت ایمیدازول به کار رفت. تمامی نمونه ها روی ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی اکریل آمید برده شدند و محاسبه میزان پروتئین تخلیص شده با آزمون میکروبرادفورد صورت گرفت. یافته ها: در دورهای 20 و 25دور در دقیقه بخش زیادی از پروتئین امتزاجی وارد بخش محلول شد. در روش له کردن در نیتروژن مایع، پروتئین ها بیشتر وارد بخش رسوب شدند. تخریب سلول ها در روش شیمیایی کامل بود. شکستن سلول ها با هموژناسیون تحت فشار 50بار، بیشتر از 15بار بود. در تخریب شیمیایی همراه با سونیکاسیون مقدار بسیار زیادی از پروتئین امتزاجی وارد بخش محلول شد. در شرایط غیرواسرشته هیچ پروتئین امتزاجی نوترکیبی با بافر جداسازی از ستون خارج نشد، اما در شرایط واسرشته مقدار زیادی از پروتئین تخلیص شد. نتیجه گیری: در تخریب شیمیایی همراه با سونیکاسیون، 7/97% پروتئین کل به بخش محلول وارد می شود و تخلیص در شرایط واسرشته برخلاف شرایط غیرواسرشته به طور مناسب و مطلوب صورت می گیرد.

سابقه و هدف جوش نخوردن شکستگی استخوانی یک چالش درمانی برای جراحان و متخصصین می باشد. یکی از راهکارهای درمانی جهت تحقق این هدف، درمان سیستمیک است. این مطالعه با هدف تعیین اثر داروی سینوپار (تری پاراتید) در شکستگی های جوش نخورده استخوان های بلند انجام شده است. مواد و روش ها این مطالعه نیمه تجربی بر روی 16 بیمار مبتلا به شکستگی جوش نخورده استخوان های بلند انجام شده است. در این مطالعه قبل از مداخله درمانی، گرافی از محل شکستگی تهیه شده و پس از تایید جوش نخوردن توسط رادیولوژیست، بیمار تحت درمان 3 ماهه با داروی سینوپار (تری پاراتید) قرار گرفت. بعد از این مدت مجددا برای هر بیمار گرافی تهیه شد تا بهبودی و اثربخشی درمان ارزیابی شود. یافته ها میانگین سنی 16 بیمار مورد بررسی 51/20 ± 18/45 سال بود. از این تعداد 9 نفر مذکر و 7 نفر مونث بودند. میانگین مدت زمان سپری شدن از حادثه 48/24± 00/50 هفته بوده است. بیش ترین محل آسیب دیده در بیماران ناحیه فمور (8 مورد) بوده است. از میان 16 بیمار بعد از درمان نشانه های بهبودی در 10 بیمار رویت شد (002/0=P). استنتاج تا حدودی از نتایج این مطالعه می توان نتیجه گرفت که درمان انجام شده با سینوپار موثر بوده است ولی به علت تعداد کم نمونه هم چنان اثربخشی واقعی داروی سینوپار ناشناخته باقی مانده است.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

مقدمه: باکتری بورخولدریا سودومالیی عامل بیماری میلوییدوزیس است. BLF1 نقش مهمی در بیماری زایی و ایجاد عفونت توسط بورخولدریا سودومالیی دارد. STxB نقش ادجوانتی و حاملی را داراست و می توان با ممزوج کردن آنتی ژن های کاندیدای واکسن با این ادجوانت، به تولید واکسن مناسب پرداخت. هدف این تحقیق ساخت و ارزیابی ایمنی زایی نانوذره تری متیل کایتوزان حاوی پروتیین BLF1-stxB به صورت تزریق زیرجلدی است. مواد و روش ها: در این مطالعه، بیان پروتیین نوترکیب BLF1-stxB در میزبان بیانی القا و پروتیین به روش کروماتوگرافی میل ترکیبی تخلیص شد؛ سپس ساخت نانوذره به روش ژلاسیون یونی صورت گرفت و اندازه و شکل ظاهری نانوذره توسط میکروسکوپ الکترونی انجام و به صورت زیرجلدی در چهار نوبت به موش تزریق گردید. ارزیابی تیتراسیون آنتی بادی به روش الایزای غیرمستقیم صورت گرفت. برای بررسی ایمنی زایی از سم BLF1 استفاده شد. یافته ها: نتایج این تحقیق نشان داد که نانوذرات حاوی پروتیین نسبت به نانوذرات بدون پروتیین، اندازه، PDI بالاتر و پتانسیل زتای پایین تر دارند. میزان بارگذاری پروتیین در نانوذره در حدود 65 درصد بود. بالاترین تیتر آنتی بادی مربوط به گروه دریافت کننده پروتیین بدون نانوذره بود. نتایج چالش حفاظت 75 درصد گروه موشی دریافت کننده پروتیین بدون نانوذره را نشان داد. بحث و نتیجه گیری: این تحقیق نشان داد که گونه نانوذره حاوی این پروتیین نوترکیب در مقایسه با گونه بدون نانوذره، به صورت تزریقی به بروز پاسخ ایمنی ضعیف تری منجر می شود. نتایج چالش نشان داد که این پروتیین کایمر نوترکیب در حالت تزریق زیرجلدی همراه ادجوانت، حفاظت مناسب تری را ایجاد می کند.

باکتری اشرشیاکلی یکی از مهمترین میزبان ­های مورد استفاده برای تولید پروتئین نوترکیب می ­باشد. به عنوان مثال، بیشتر پروتئین­ های دارویی که توسط سازمان غذا و داروی آمریکا جهت مصرف مورد تایید قرار گرفته ­اند در اشرشیاکلی تولید شده اند. یکی از مزیت­ هایی که این موجود را به یک کارخانه مناسب جهت تولید پروتئین­های نوترکیب تبدیل کرده، شناخت کامل ماهیت زیستی آن می­ باشد. این امر سبب شده است که در سال­ های اخیر امکان ایجاد تغییرات جهت دار برای مبدل ساختن این کارخانه کوچک به سامانه­ ای هوشمند برای ساخت آسان­تر انواع پروتئین ­های نوترکیب با ویژگی­ های گوناگون فراهم شود. به طوری که هم اکنون سویه­ های مهندسی شده­ ی مختلف و بسیار پرکاربردی برای تولید مقدار بالا و پایدار پروتئین­ های مورد نظر از سویه­ های والد و وحشی به دست آمده است که در آزمایشگاه و صنعت قابل استفاده می­ باشد. در این مقاله مروری ما به معرفی تعدادی از این سویه­ ها که پرکاربردتر هستند می­ پردازیم.

سابقه و هدف: استفاده از شاخص های آنتی ژنیک انتامباهیستولیتیکا مانند آنتی ژن پروتئین غنی از سرین انتامباهیستولیتیکا SREHP)) جهت تهیه واکسن، برسی تنوع ژنتیکی و تشخیص قطعی و افتراق آن از انتامبا دیسپار کاربرد بیشتری پیدا کرده است. این مطالعه با هدف بیان پروتئین نوترکیب غنی از سرین انتامبا هیستولیتیکا به منظور استفاده در کیت تشخیصی الایزا انجام شد.روش بررسی: در این تحقیق که یک روش توصیفی از نوع اکتشافی است، ابتدا ژن SREHP ایزوله ایرانی که قبلا در پلاسمید بلواسکریپت (pBSc) کلون شده بود، با استفاده از آنزیم BamHI جدا گردید و پس از تخلیص از ژل در پلاسمید بیانی pET32a کلون شد. از روش های غربالگری شامل روش سریع (Quick check) با استفاده از محلول Rosconis، PCR با پرایمرهای اختصاصی SREHP و pET و برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و HindIII جهت تایید کلونینگ استفاده شد. ترادف نوکلئوتیدهای ژن با روش سکوئنسینگ تعیین گشت و پلاسمید نوترکیب حاوی ژن SREHP جهت تکثیر به سلول پذیرای BL21(DE3) انتقال یافت. در نهایت ازکلنی حاوی پلاسمید نوترکیب کشت انبوه تهیه شد و پروموتور ژن با IPTG القا و وجود پروتئین نوترکیب بر روی ژل SDS-PAGE بررسی گردید.یافته ها: ژن SREHP در پلاسمید بیانی pET32a ساب کلون گردید و صحت کلونینگ با روش های غربالگری سریع (Quick check)، PCR با پرایمرهای اختصاصی SREHP و pET T7 promoter و برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و HindIII تایید شد. ترادف نوکلئوتیدهای ژن با اندازه 666 نوکلئوتید تعیین گشت و ژن کلون شده در پلاسمید بیانی در حضور IPTG در مدت زمان 5 ساعت در محیط کشت ابراز شد. وجود پروتئین نوترکیب غنی از سرین انتامبا هیستولیتیکا به انضمام تیوردوکسین (Trx-Tag) موجود در pET32a با وزن ملکولی 44 کیلودالتونی در کنار مارکر بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده و مورد تایید قرار گرفت.نتیجه گیری: با توجه به کاربرد زیاد پروتئین نوترکیب غنی از سرین انتامباهیستولیتیکا در تهیه کیت های تشخیصی و تهیه واکسن از آن علیه تک یاخته انتامباهیستولیتیکا، در این مطالعه پروتئین سرین ریچ (SREHP) با موفقیت بیان شد.

امروزه با استفاده از مهندسی ژنتیک، پروتئین های نوترکیب می توانند در حجم انبوه، کیفیت مطلوب و هزینه پایین برای پاسخگویی به خواسته های صنایع مختلف تولید شوند. پروتئین های نوترکیب می توانند در روش های بیانی مختلفی نظیر سیستم های بیانی عاری از سلول یا بر پایه سلول های پروکاریوتی یا یوکاروتی بیان شوند. با توجه به مزایای استفاده از سلول های پروکاریوتی، یکی از سیستم های متداول برای تولید پروتئین های نوترکیب، استفاده از باکتری اشریشیاکلی (E. coli) است. هدف از مطالعه حاضر بررسی دقیق تر بیان پروتئین نوترکیب در باکتری E. coli و ارایه راه کارهای مناسب برای دستیابی به کشت با تراکم سلولی بالا و با قابلیت بیان بیشینه است. از این رو با مطالعه حدود 63 مقاله چاپ شده در زمینه مهندسی ژنتیک، سیستم های بیانی گوناگون برای تولید پروتئین های نوترکیب معرفی و سپس راهکارهای عمومی برای بیان بالاتر آنها بررسی شدند. رویکردهای متعددی برای افزایش بازدهی و حلالیت به کار گرفته شده است؛ تغییر سرعت سنتز پروتئین ها، استفاده از پروتئین های اتصالی، موتاسیون در پروتئین هدف، بیان هم زمان چاپرون های ملکولی و بهینه سازی شرایط کشت از جمله روش هایی است که در این مطالعه ارزیابی شده اند. کلونینگ مجازی در بستر توسعه روش های نرم افزاری و پایگاه های اطلاعاتی غنی تر به کمک ابزار و آزمون های آزمایشگاهی آمده و توانسته است به رفع محدودیت های بیان نوترکیب پروتئین ها در میزبان هایی با سیستم بیانی متفاوت منجر شود.

مقدمه: ویبریوکلره یک باکتری گرم منفی است که باعث ایجاد بیماری وبا می شود. به دنبال خوردن مواد آلوده به این باکتری، باکتری در روده باریک میزبان شروع به کلونیزاسیون و تولید انتروتوکسین می کند. یکی از مهمترین عوامل بیماری زای باکتری پیلی (TCP) است. این پیلی به عنوان اولین فاکتور در کلونیزاسیون و تداوم باکتری ها در روده کوچک مورد نیاز است. باکتری پیلی هم- تنظیم شونده با توکسین به صورت پیلی تشکیل دهنده دسته ای است که به شکل هماهنگ با توکسین کلرا (CT) تنظیم می شود. توکسین کلره به عنوان بخشی از ژنوم باکتریوفاژ رشته ای (CTXQ) است، به طوری که این باکتریوفاژ از پیلی هم- تنظیم شونده با توکسین به عنوان گیرنده خود استفاده می کند. هدف از این مطالعه تولید یک واکسن نوترکیب برای ویبریوکلره در آینده است.روش: در این مطالعه ژن tcpB با روش PCR تولید شد. سپس به داخل وکتور بیانی pET32 a وارد گردید. سلول های مستعد E.coli. BL21(DE3)plays به وسیله پلاسمید نوترکیبpET32 a – tcpB  ترانسفورم گردید. سپس در محیط های کشت متفاوت با تغییر دادن پارامترهایی مثل گلوکز به عنوان منبع کربن، عصاره مخمر به عنوان منبع نیتروژن، بیان پروتئین با استفاده از IPTG انجام شد. پروتئین نوترکیب به وسیله کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA تخلیص گردید. در نهایت میزان پروتئین خالص شده با استفاده از روش براد فورد اندازه گیری شد. یافته ها: نتایج تعیین توالی با روش سنجر نشان داد که توالی ژن شباهت کامل باژن tcpB دارد. باکتری E.coli,BL21(DE3), plysS به وسیله pET32a-tcpB ترانسفورم شد و بیان ژن به وسیله IPTG صورت گرفت. پروتئین بیان شده توسط کروماتوگرافی تمایلی و به وسیله کیت Ni-NTA تخلیص گردید.نتیجه گیری: تولید پروتئین نو ترکیبtcpB ، ویبریوکلره در سیتوپلاسم باکتری اشریشیا کلی با استفاده از پلاسمید بیانی pET32a انجام گرفت. تولید این پروتئین در میزبان اشریشیا کلی سویه plysS با استفاده از وکتورهای بیانی مثل  pET 32aدر این مطالعه امکان پذیر است.